一、實驗目的
本方案依托適配微量樣品的芬蘭Kibron‑Epsilon微量探針以及Delta‑8微孔板檢測模塊，僅取用10 μL原始發酵上清，不進行濃縮、萃取等前處理，直接完成動態表麵張力測定。
常規微生物胞外表麵活性物質篩查往往需要大量菌液、濃縮富集，操作繁瑣還容易造成活性組分損耗；該微量檢測方法能夠節省發酵樣品、適配微量搖管、微孔培養體係，實現高通量、低損耗測定原液當中生物表麵活性劑、胞外多糖、蛋白混合物的界麵吸附特性，適合大批量菌株初篩、時間梯度取樣、多組環境變量試驗。
二、實驗前期準備
1.儀器與耗材準備
核心儀器：芬蘭Kibron‑Epsilon配備微量Wilhelmy探針、微量樣品池；高通量篩查選用Kibron Delta‑8低體積微孔傳感組件；配套帕爾貼恒溫基座、專用微量石英樣品槽、低吸附384孔微孔板、探針火焰清潔裝置、設備采集軟件。
輔助設備：高速冷凍離心機、微型高速離心管、0.22 μm水係濾膜、超聲清洗儀、微量移液槍（0.5‑10 μL量程）、無菌微量離心管。
實驗耗材：待測細菌/藻類發酵原液、磷酸鹽緩衝液、無水乙醇、異丙醇。
儀器預處理規範
整機通電預熱30 min，設置和微生物培養一致的恒溫參數，整次試驗溫度固定不變。
微量金屬探針相較於常規探針更容易吸附有機質，每次測試前丁烷火焰充分灼燒，灼燒之後放置恒溫台冷卻至設定溫度；校準純水表麵張力，基線連續30 min波動小於0.2 mN/m才可開展檢測。
微量樣品槽、384孔微孔板依次異丙醇擦拭、無水乙醇衝洗、超純水衝洗，氮氣吹幹；禁止手指觸碰槽體內部，避免皮脂汙染界麵。儀器放置減震台麵，閉合防風結構，規避氣流擾動微量液麵。
2.菌株培養、樣品製備與微量上清預處理
微生物發酵培養
使用微量搖管、96孔深孔板開展微生物搖瓶培養，單份培養體係體積可以低至50‑200 μL，節省培養基耗材。按需設置生長時間梯度、pH梯度、碳源實驗組，每組設置3組生物學平行。
空白對照組為沒有接種菌體、同等條件培育的空白培養基。
微量發酵上清製備步驟
1.取出微量培養體係，移入微型離心管，8000 r/min離心15 min，菌體、沉澱沉降至管底；
2.使用10 μL規格微量移液槍，緩慢吸取上層澄清發酵上清，取樣體積嚴格取用10 μL；
3.上清肉眼可見細小菌體碎屑時，可以采用水係微量濾頭緩慢過濾；離心後溶液通透清亮則跳過過濾，防止疏水表麵活性劑被濾材吸附損失；
4.10 μL待測液輕柔吹打混勻，超聲脫氣3‑5 min去除微氣泡，超聲功率調低，避免樣品揮發；
5.取樣之後立刻上機檢測，微量樣品溶劑極易揮發，常溫存放時長不可超過5 min，禁止冷凍、濃縮、烘幹處理，保持原液組分。
3.預實驗基線驗證
吸取10 μL空白培養基加入微量樣品池，運行90 min動態張力檢測，確認張力曲線平穩，無持續性下降，培養基不存在表麵活性雜質。
取用高活性菌株10 μL原液測試，觀察表麵張力下降幅度，驗證微量探針可以捕捉原液當中胞外活性物質的界麵信號。
三、標準化上機檢測完整操作流程
分為單通道微量樣品池檢測、384孔板高通量微量篩查兩套操作流程
1.Kibron‑Epsilon微量探針檢測流程
1.使用微量移液槍吸取10 μL脫氣完成的發酵上清，緩慢滴入微量石英樣品槽底部，盡量使液體均勻鋪開，禁止產生氣泡；一旦出現氣泡作廢重新取樣；
2.將微量樣品槽安放至帕爾貼恒溫基座，關閉防風罩靜置8 min，穩定氣‑液界麵、溫度；
3.操控微量探針下降，探針接觸液體表層，啟動動態表麵張力檢測程序；考慮樣品量少、溶劑容易揮發，采集時長設置60 min，記錄張力‑時間變化曲線，讀取平衡表麵張力；
4.測試結束之後升起微量探針，火焰灼燒清除附著物；倒掉微量廢液，樣品槽乙醇清洗、純水衝洗吹幹，準備下一組樣品。
2.Delta‑8高通量微量篩查流程
1.384孔低吸附微孔板每一個孔精準加入10 μL發酵上清；
2.微孔板加蓋減少水分揮發，恒溫環境靜置平衡25 min；
3.放置恒溫載板開啟序列自動檢測，每個微孔重複檢測三次取平均值；
4.整板測試結束之後執行探針陣列高溫灼燒清潔；每隔12個樣品孔放置空白培養基，用來監測基線漂移。
3.平行樣品質控標準
三份平行10 μL原液測得平衡表麵張力差值大於0.5 mN/m，則重新離心取樣、脫氣複測；所有樣品恒溫條件、界麵靜置時長、探針下落參數全部統一。
4.實驗收尾和儀器養護
全部微量樣品檢測完畢，反複灼燒清理微量探針表麵粘連的胞外多糖、蛋白、生物表麵活性劑；微量樣品槽有機溶劑浸泡清洗。導出動態張力曲線、張力數值；探針幹燥存放，做好防塵。
四、數據處理以及原液活性評價標準
1.界麵參數提取
獲取吸附誘導時長、張力下降速率、平衡表麵張力、平台穩定性。因為樣品沒有濃縮，檢測結果可以直接代表原始發酵上清真實界麵活性。
2.菌株活性分級判定
平衡表麵張力越低、張力下降速率越快，該菌株原液分泌的表麵活性物質含量越高；
對比不同培養條件組別，篩選出可以高效產出胞外活性劑的環境參數；
空白培養基張力數值作為基線，計算各組原液的張力下降幅度。
五、關鍵實驗控製要點
1.微量探針接觸麵積很小，發酵液黏性胞外有機物極易附著探針，每一次檢測之後必須灼燒清潔；檢測順序優先測試低活性樣品，之後測試高活性發酵上清，規避交叉汙染。
2.10 μL樣品揮發風險很高，全程關閉防風罩、縮短靜置時長，操作動作迅速；環境溫度恒定，溫度波動會加速微量水分揮發造成樣品濃縮。
3.移液操作輕柔，吹打次數不宜過多，禁止引入微小氣泡；氣泡會消耗原液內的兩親活性分子，讓動態吸附動力學數據失真。
4.盡量省去過濾步驟，疏水脂肽、糖脂類活性物質很容易吸附在濾膜，造成檢測得到的表麵張力偏高，低估原液活性。
5.該方法屬於原液直接表征，不需要濃縮，不會改變物質原有配比；界麵張力是多糖、脂蛋白、生物表麵活性劑多種胞外分泌物的綜合結果；如需定量活性組分，後續單獨開展萃取‑色譜分析。
6.微量樣品池每次用完徹底清洗，殘留黏性代謝物會幹擾後續微量液麵狀態。
